Post-translationelle und post-transkriptionelle Prozesse zur Modifizierung der Qualität und Quantität industriell relevanter Enzyme

Wiss. Kontakte und Kooperationen: Structural Biology Laboratory, University of York, UK; Institut für Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, TUHH; ITQB Univesidade Nova de Lisboa

Am Beispiel bakterieller Penicillinamidase werden phenomenologische ausbeutelimitierende Prozesse, wie mRNA-Stabilität und mRNA-Abbau, intrazelluläre Proteolyse des Prekursors, Translokation durch die Cytoplasmamembran, autokatalytische Maturation, produktive Faltung und nicht-produktive Aggregation, Bindung von Kationen, untersucht.

Durch gezielte Mutagenesen (site-directed mutagenesis) hat es im Rahmen unserer bisherigen Arbeiten gelungen, den Prozessierungsmechanismus der PA von Escherichia coli zu blokieren und unprozesierten Prekursor in preparativen Mengen mittels Affinitätschromatographie zu isolieren, um den posttranslationalen Prozesierungsweg zu klären. Die autoproteolytische Aktivierung und der Transport des PA-Prekursors durch die Cytoplasmamembran ist daher als Konkurenzreaktion zur cytoplasmatischen Aggeragation und proteolytischen Degradation anzusehen, wobei 80% des synthetisierten Vorläuferproteins abgespaltet wird. Die intramelekulare Pro-Sequenz dient als interner Faltungskatalysator und katalysiert die produktiven Faltung der gesamten Proteinmoleküls. Fragmente vom partiell autokatalytisch abgespalteten Pro-Peptid aktivieren die mature PA and mit Hilfe gezielter Mutagenese konnten einige dieser Spaltestellen blockiert werden und somit die Penicillinamidasen mit erhöhter Aktivität erzeugt werden. Durch Expressionen unter depletierten Translokationsbedingungen wurde es möglich, den Exportmechanismus von E. coli PA durch die cytoplasmatische Membran zu identifizieren und als Tat-abhängig zu gliedern.Das nicht an katalytischen Mechanismus beteiligte Ca-cation verringert deutlich die Ausbeute an aktivem Enzym falls nicht ausreichend im Nähmedium während der Biosynthese vorhanden.

Mit Hilfe der gentechnischen Konstruktionen wurde es möglich, neuen PA-Varianten (Hybridgenen) zu klonieren und zu exprimieren, in denen A- und B-Peptid-kodierende DNA-Sequenzen verschiedener Species miteinander kombiniert wurden, um bestimmte Eigenschaften der PA im Hinblick auf eine optimalere Anwendung des Enzyms als Biokatalysator zu verändern.

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